Fantominka

Комплексная лабораторная диагностика

Recommended Posts

Fantominka    0

Дорогие женщины!

Нижеприведенный материал был написан как лекционный для профессиональной аудитории. У меня нет сил и желания переписывать его в более популярной форме, поэтому если у кого то из вас возникнут вопросы по данному материалу, вы можете задать их на форуме.

Применяя тот или иной метод диагностики, лечащий врач, часто хотел бы знать с какой вероятностью можно доверять методу. Самый лучший метод с его точки зрения должен иметь сто процентную надежность: получил результат одного метода, +/- и думать не надо. Но тогда лечащие врачи были бы не нужны, а многие пациенты даже сейчас (при наличии врачей всех специальностей), стремятся заниматься самолечением, считая, что получил результат, открыл справочник и пей таблетки. Но если бы это было так просто, тогда врачи-лечебники были бы точно не нужны.

Зачем же они нужны? Зачем мы нужны пациенту?

А нужны мы совсем не для того, чтобы получив данные лабораторного обследования и сравнив результат анализа с нормой – открыть справочник и не задумываясь назначить лечение. Это может сделать, правда иногда без успеха на излечение, и сам пациент. Врач же нужен для того, чтобы обеспечить по возможности излечение, а это значит, он должен думать, анализировать и на основании этого назначать соответствующее лечение. И это необходимо еще и потому, что нынешний уровень науки и техники еще не позволил создать такой единственной методики обследования по абсолютному большинству заболеваний, которая бы со 100 процентной гарантией диагностировала то или иное заболевание. И сейчас предпринимается множество попыток найти этот единственный метод (самый лучший, самый - самый) и для того, чтобы формализировать практическую ценность различных методов диагностики, исследователями были введены понятия чувствительности, специфичности, прогнозируемого значения. Эти понятия, применимые для любого качественного, т.е. отличного от количественного метода диагностики заболеваний, нашли широкое применение только в лабораторной диагностике и это свидетельствует о том, что без знаний врача говорить о применении того или иного метода диагностики со 100 процентной надежностью просто безграмотно.

Для каждого метода диагностики можно вывести свой показатель чувствительности и специфичности, что уже собственно и проделано многими исследователями. Однако любой врач, используя тот или иной метод диагностики, применяет его к конкретному пациенту с его анамнезом и клиникой. И часто получается так, что только комплексное обследование позволяет правильно поставить диагноз.

Мой сегодняшний доклад посвящен двум методам лабораторной диагностики различных инфекций:

[*]применяемому в нашей лаборатории методу иммуноферментного анализа (ИФА) и

[*]методу полимеразной цепной реакции (ПЦР)

(продолжение следует)

Поделиться сообщением


Ссылка на сообщение
Поделиться на других сайтах
Fantominka    0

Комплексная лабораторная диагностика – основа точного диагноза

Как вам известно, в настоящее время во всем мире идет активная работа по расшифровке геномов различных микро- и макроорганизмов, в том числе и человека. Ожидается, что к 2003 году (примечание автора: приводимый материал был написан в 2002 году) геном человека будет полностью расшифрован. В настоящее время уже расшифрованы нуклеотидные последовательности многих вирусов и бактерий. Существуют компьютерные банки данных, где можно получить информацию о нуклеотидной последовательности практически всех известных возбудителей инфекционных заболеваний.

В последнее десятилетие бурно развиваются технологии, основанные на достижении генной инженерии и молекулярной генетики. Эти научные разработки быстро выходят из стен элитарных институтов и внедряются в медицинскую практику, становясь незаменимым инструментом, при помощи которого современный врач может правильно диагностировать и своевременно проводить лечение заболеваний, вызываемых различными инфекционными агентами.

Более 15 лет назад (1983 год) американский ученый Кэри Мюллис изобрел метод полимеразной цепной реакции, позволяющий клонировать в условиях ин витро (в пробирке) любой участок ДНК любого организма, за что удостоился Нобелевской премии. Очень быстро этот метод распространился по всему миру и переместился в сферу практического клинического использования, где позволил диагностировать

[*]инфекционные заболевания, в том числе вызываемые агентами, трудно поддающимися культивированию у серонегативных пациентов, когда лечение наиболее эффективно

[*]выявлять персистирующие, латентные и рецидивирующие формы инфекций

[*]проводить генотипирование микроорганизмов

[*]оценивать их вирулентность

[*]определять устойчивость микроорганизмов к антибиотикам

[*]осуществлять контроль эффективности лечения

[*]проводить диагностику оппортунистических инфекций, часто протекающих на фоне иммунодефицита, вследствие чего постановка диагноза только по результатам серологических исследований затруднена из-за имеющихся несоответствий между параметрами иммунного ответа и протекания заболевания

[*]разрешать сомнительные результаты серологических исследований

[*]проводить эпидемиологические исследования

[*]выявлять наиболее патогенные штаммы инфекционных агентов

[*]исследовать инфекционность пулированных образцов крови и ее продуктов, применяемых в терапии

[*]проводить генодиагностику и генетическую дактилоскопию

[*]осуществлять пренатальную диагностику

Как вы помните еще из курса биологии за 10 класс любой микроорганизм представляет собой совокупность клеток, имеющих в своем составе ядро и другие внутриклеточные системы. В ядре находятся хромосомы, имеющие универсальный носитель генетической информации – дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) – сейчас мы не будем касаться РНК-содержащих организмов.

ДНК представляет собой двойную нить, скрученную в спираль. Каждая нить состоит из соединенных последовательно нуклеотидов четырех типов – аденин, гуанин, тимин, цитозин. Последовательность из трех нуклеотидов кодирует одну аминокислоту. Чередование нуклеотидов в ДНК обеспечивает кодировку всех молекул белка, образующихся в данном организме. Нуклеотиды попарно комплементарны, как вы помните и, взаимодействие между ними - принцип комплементарности обеспечивают, в том числе и водородные связи. Нити ДНК, как я уже упоминала, сложены между собой в двойную нить, скрученную в спираль. Эти нити имеют противоположную направленность: 5 – штрих концу одной нити, соответствует 3-штрих конец второй нити. Построение нити ДНК идет от 5-штрих конца к 3-штрих концу. В таком выстроенном состоянии организм живет и здравствует пока не придет его время размножения или пока, мы, врачи, не возьметесь плотно за него.

В момент размножения или достройки необходимых организму белков, специальные ферменты расплетают спираль ДНК в том участке, где должна произойти репликация. Другие ферменты обеспечивают разрыв водородных связей и расхождение нитей. Одна из цепей ДНК становится матричной. На ней при помощи фермента – ДНК-полимеразы, обеспечивается построение отдельных нуклеотидов второй цепи ДНК, которая строго комплементарна первой. Достройка цепи по принципу комплементарности, как я уже упоминала, начинается с 5-штрих конца. Тоже самое, только в обратном направлении происходит на второй нити ДНК, однако, т.к. расплетение молекулы идет в обратном направлении, то новая цепь строится небольшими фрагментами, которые затем сшиваются.

Жил таким образом наш микроорганизм жил и пришло ему время реплицироваться. Чтобы это знаменательное событие произошло, т.е. чтобы ДНК-полимераза начал свою работу, тр*цензура*ется наличие праймера – небольшого одноцепочечного фрагмента ДНК, который соединяясь с комплементарным участком одной из цепей родительской ДНК образует стартовый блок для наращивания дочерней цепи.

Таким образом, репликация ДНК включает в себя 3 основных стадии

[*]расплетение спирали ДНК и расхождение нитей (денатурация)

[*]присоединение праймера

[*]достраивание дочерней цепи

Каким же образом проводится данный анализ?

Врач производит забор материала из доступных точек макроорганизма, в котором предполагается наличие антигена, и помещает его в пробирку. Согласно предполагаемому антигену, заказанному врачом, лаборатория добавляет в эту же пробирку два праймера и осуществляет реакцию амплификации ин витро, т.е. реакцию удвоения участка ДНК предполагемого антигена, находящегося в забранном материале. Время синтеза занимает 20 – 40 секунд, а весь цикл – около 3 минут.

Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации в котором происходит образование специфического фрагмента ДНК-ампликона. В последующих циклах ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей.

Таким образом, за определенное количество циклов амплификации происходит накопление ампликона (антигена) в растворе. И даже если при заборе материала в него попала только одна молекула искомой ДНК, то за 30 – 40 циклов амплификации в растворе будет около 108 молекул ампликона, который потом выявляется с помощью элкектрофореза в агарозном геле.

Длина пробега ДНК в агарозе зависит от размера молекулы ДНК, а поскольку размер образующихся в результате ПЦР ампликонов известен, метод электрофореза позволяет точно их идентифицировать. Окрасив фореограмму и поместив гель в лучи ультрафиолета, мы увидим наличие розовой полосы в той пробе, где присутствует исследуемая ДНК и отсутствие полосы в пробе, не содержащей искомой ДНК.

Если в забранном материале не окажется ни одной молекулы ДНК, например, хламидии, участок которой комплементарен внесенным праймерам, даже не смотря на то, что в материале будет миллионы молекул ДНК других организмов, реакция ПЦР с праймером хламидии не пройдет.

Таким образом можно диагностировать любой ДНК – содержащий организм (хламидии, микоплазмы, уреаплазмы и др).

Для ПЦР-анализа РНК-содежащих инфекционных агентов после забора материала вначале проводят стадию обратной транскрипции – получение ДНК, комплементарной вирусной РНК-матрице, для чего используют специфические праймеры к РНК и фермент РНК-зависимую – ДНК-полимеразу (обратную транскриптазу, ревертазу). После чего проводят ДНК анализ по вышеизложенной схеме.

Методом ПЦР, который постоянно совершенствуется, в настоящее время можно проводить не только качественный, но и количественный анализ выявленного организма, оцениваемый в количестве копий геномов на пробу (полный цикл).

С целью повышения точности анализа ПЦР в настоящее время используют 2-х стадийную ПЦР, когда проводится 2 амплификации с применением внешних и внутренних праймеров.

С помощью подбора праймеров на генетически изменчивых участках ДНК микроорганизмов разрабатываются системы, позволяющие генотипировать микроорганизм и выявить формы, обладающие большей вирулентностью или устойчивостью к антибиотикам.

В настоящее время метод ПЦР постоянно развивается и совершенствуется. Преимущество этого метода заключается в том, что он

[*]позволяет прямо определять наличие возбудителя

[*]обладает высокой специфичностью, которая обусловлена фрагментами ДНК, характерными только для данного возбудителя

[*]обладает высокой чувствительностью, что позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов

[*]метод универсален в плане выявления различных возбудителей, т.к. материалом для исследований служит ДНК организма. В качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические выделения (слизь, мокрота, моча, сперма, слезная жидкость), соскобы эпителиальных клеток, биоптаты, клетки крови, сыворотка

[*]позволяет диагностировать хронические и латентные инфекции с высокой антигенной изменчивостью возбудителей и внутриклеточных паразитов

[*]высокая скорость получения результата – полный анализ можно провести за 4 – 5 часов

Ложноположительный результаты могут проявиться при перекрестной контаминации от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси) или возникнуть при контаминации рекомбинантными плазмидами, содержащими клонированные последовательности детектируемого гена. Вследствие чего при проведении работ с использованием ПЦР необходимо:

[*]территориально разделять различные стадии анализа, размещая их в различных помещениях

- помещения для подготовки проб

- помещения для постановки ПЦР

- помещения для детекции результатов ПЦР

Кроме того, подготовку реагентов для выделения нуклеиновых кислот, проведения ПЦР и детекции результатов ПЦР предпочтительно проводить в отдельном помещении (пре-ПЦР, биохимическая)

[*]для каждой стадии анализа должен быть свой комплект лабораторной одежды, автоматических пипеток, вспомогательных материалов и оборудования

[*]работу на всех этапах проводить только с использованием одноразовых расходных материалов: пробирок, наконечников, пипеток и пр.

[*]необходима постоянная постановка отрицательных контрольных образцов как на реагенты для подготовки проб (выделение ДНК), так и на реагенты для проведения ПЦР

[*]работу должен проводить специально обученный персонал, обладающий достаточной квалификацией в данной области

[*]для контроля чувствительности проводимого анализа необходима постоянная постановка положительных контрольных образцов

Эффективный путь в использовании и развитии методов генодиагностики – это создание централизованных ПЦР-лабораторий, оборудованных и организованных в соответствии с необходимыми требованиями и имеющих квалифицированный персонал.

Однако даже при выполнении всех вышеперечисленных условий широкое использование ДНК-дагностики ни в коей мере не отменяет методы иммунохимических исследований (ИФА, ПИФ, РИФ и др), а дополняет их.

В нашей лаборатории используется метод иммуноферментного твердофазного анализа антигена на планшетах для иммуноанализа с использованием специфических моно– и поликлональных антител.

(продолжение следует)

Поделиться сообщением


Ссылка на сообщение
Поделиться на других сайтах
Fantominka    0

В основе этого метода лежит иммунная реакция между антигеном и антителом. Наша лаборатория проводит эту реакцию в модификации, заключающейся в использовании метода двойного связывания.

Суть этого метода в следующем. На планшету для иммуноанализа, с фиксированным к поверхности лунок твердофазным очищенным антигеном, наносится сыворотка пациента, предположительно содержащая иммуноглобулины к данному антигену. При наличии у пациента антител в лунке планшета происходит первая реакция связывания антителом антигена. После этого планшет отмывается. При этом несвязавшиеся компоненты исследуемой пробы удаляются, а на стенках лунок остается комплекс антиген +антитело.

Чтобы выявить этот иммунный комплекс проводится 2-я иммунологическая реакция, в которой в качестве антигена выступает связавшийся иммуноглобулин, а в качестве антитела – конъюгат, представляющий собой иммуноглобулины (например, кролика) к соответствующему иммуноглобулину человека, который помечен пероксидазой хрена. После завершения второй реакции планшета вновь отмывается и далее проводится ферментативная реакция, катализируемая ферментной частью молекулы конъюгата. В ходе этой реакции образуется окрашенное вещество, интенсивность окраски которого зависит от количества содержащихся в пробе иммуноглобулинов.

После остановки ферментативной реакции проводят фотометрирование лунок и далее с учетом значений оптической плотности контрольных проб проводят математическую обработку результатов анализа. Чем выше оптическая плотность в лунке, тем больше антител содержится в пробе и, следовательно, выше титр анализируемой сыворотки. При отсутствии антител лунки остаются неокрашенными.

Для исследования методом ИФА используется кровь из локтевой вены.

К достоинствам ИФА можно отнести высокую чувствительность, специфичность, воспроизводимость, унифицированность и пригодность для массовых обследований. Возможность инструментальной оценки результатов устраняет фактор субъективности.

Этот метод исследования можно также использовать, если очаг инфекции недоступен для взятия образца на анализ ДНК («высокая» инфекция). В этом случае выявление специфических антител может являться единственным лабораторным анализом для подтверждения инфекции.

С другой стороны методом ИФА определяют только реакцию иммунной системы пациента на данного возбудителя, т.е. косвенно, по наличию антител, определяют (возможно, даже бывшее) наличие антигена в организме.

Говоря о бывшем наличии антигена в организме я подразумеваю именно механизм выработки и элиминации антител, который вам хорошо известен и который в организме происходит по определенным законам. Знание этих законов позволяет правильно интерпретировать получаемые результаты.

Вы помните, что с момента попадания любого чужеродного белка (антигена) в организм иммунная система этого организма начинает генерировать ответ в виде пролиферации В-лимфоцитов и образовании, в конечном итоге, специфических иммуноглобулинов – антител. Для реализации этого процесса иммунной системе необходим определенный промежуток времени, в течение которого (при первичном заражении), методом ИФА выявить антитела не удается, потому что их в крови еще нет (система не наработала), а заражение уже есть (серонегативный период). Т.е. в этом случае, учитывая данные анамнеза, оптимально прямое определение возбудителя, еще до проявления иммунного ответа.

При длительном контакте иммунной системы с антигеном последняя продолжает давать сигнал на синтез антител с целью элиминации чужеродного антигена. В этом случае появляются антитела другого класса, свидетельствующие о вторичном иммунном ответе и титр антител нарастает, что можно зафиксировать методом ИФА, особенно если он применяется в динамике.

На каждый вид возбудителя вырабатываются свои определенные антитела, которые, как правило, не связываются ни с какими другими инфекционными агентами. Благодаря этому определение антимикробных антител обеспечивает достаточно высокую специфичность анализа, хотя в некоторых случаях могут быть и ложно положительные результаты, например, при диагностике урогенитальной хламидийной инфекции методом ИФА можно выявить антитела к родственным антигенам Ch. psittaci и Ch.pneumonia при отсутствии хламидии trachomatis. В этом есть более низкая специфичность данного метода по сравнению с ПЦР.

Таким же образом, при проведении лечебных мероприятий, осуществляется и обратный контроль. Однако стоит помнить, что для полной элиминации антитела необходим также определенный промежуток времени, а при некоторых инфекциях антитела класса G могут быть повышены пожизненно. Из этого можно сделать вывод, что однократное определение наличия антител к определенному возбудителю в отрыве от клинического наблюдения и дополнительных лабораторных методов обследования может привести к ошибочной диагностике и нерациональному назначению антибактериальной терапии.

Это и есть недостаток метода ИФА – непрямое определение возбудителя, определение иммунного ответа на него, который у каждого пациента может иметь индивидуальные вариации, поэтому по наличию тех или иных антител просто безграмотно ставить достоверный диагноз.

Вывод из этого можно сделать только один:

[*]

[*]

При заимствовании материала ссылка на источник обязательна.

Ребята, мне надоело видеть свои работы на других сайтах без указания ссылок, откуда эти работы содраны, пардон. Хай, ну уважайте чужой труд!

Поделиться сообщением


Ссылка на сообщение
Поделиться на других сайтах
Гость
Эта тема закрыта для публикации сообщений.